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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Ki67 Essai de prolifération cellulaire
- Ki67 Essai de prolifération cellulaire (immunocytochimie)
- Rincez les cultures cellulaires avec un tampon de phosphate 0,1 M (PO4) pendant une minute deux fois. Fixez la culture avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 20 min à température ambiante. Retirez le PFA et rincez les puits avec du PBS pendant sept minutes trois fois.
- Après le rinçage final, ajoutez 100 μl de solution bloquante (tampon phosphate salin, sérum d’ânesse normal à 5 %, sérum d’albumine bovine à 0,4 % et Triton X-100 à 0,2 %) dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 1 h. Préparez l’anticorps primaire, anti-Ki67 de lapin, en le diluant dans une solution bloquante dans un rapport de travail de 1:200.
- Retirer la solution bloquante et appliquer 100 μl de la solution d’anticorps primaire dans chaque puits. Couvrez la plaque à 96 puits et incubez les échantillons à 4 °C pendant la nuit.
- Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et rincez avec du PBS pendant 7 min, 3 fois.
- Préparez l’anticorps secondaire, âne anti-lapin Cy3 dans une solution bloquante à un rapport de travail de 1:500. Ajouter la coloration nucléaire DAPI à la solution d’anticorps secondaire à une dilution de 1:100. Après le retrait du dernier rinçage PBS, appliquez 100 μl de la solution secondaire d’anticorps/DAPI dans chaque puits. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 90 min.
- Retirer la solution secondaire d’anticorps/DAPI et bien rincer chaque solution avec du PBS pendant 7 min, 3 fois. Couvrir la plaque à 96 puits et la conserver à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
2. Imagerie automatisée et analyse de score multi-longueurs d’onde
- Chargez une plaque de 96 puits (précédemment traitée pour l’immunomarquage Ki67) dans le système HCS et laissez la plaque s’équilibrer pendant 20 min. Ouvrez le logiciel d’acquisition et d’analyse d’images du système HCS.
- Choisissez les paramètres d’acquisition de l’objectif 10X à l’aide du binning de caméra à 1 et d’un réglage de gain de 2. Trouvez le plan Z dans lequel se trouvent les cellules à l’aide de la fonction d’exposition automatique et calculez le décalage pour chaque longueur d’onde d’intérêt. Pour cette analyse, capturez des images pour DAPI (W1), Cy3 (W2). Choisissez le niveau d’intensité maximal auquel les puits de contrôle négatifs n’affichent aucun signal pour l’acquisition d’image. Vérifiez que ce réglage est approprié pour les puits positifs.
- Acquérir une plaque. Capturez des images et stockez-les dans la base de données du logiciel d’acquisition et d’analyse d’images.
- Une fois les images acquises, ouvrez le logiciel hors ligne d’acquisition et d’analyse d’images et examinez les données de plaque des images acquises ci-dessus.
- Sélectionnez l’analyse de notation multi-longueurs d’onde. Configurez les intensités minimale et maximale pour chaque longueur d’onde.
REMARQUE : La détection DAPI doit marquer la coloration autour de chaque noyau visible. Cy3 doit détecter les cellules positives avec une immunoréactivité (IR) Ki67 et ne doit pas détecter IR sous les témoins négatifs. Pour Cy3 Ki67 IR, la largeur minimale approximative était de 7 μm, la largeur maximale approximative était de 30 μm, l’intensité au-dessus du fond local était de 150 niveaux de gris et la zone colorée minimale était de 50 μm2. - Exécutez l’analyse pour tous les postes. Exportez les données pour les afficher dans une feuille de calcul.